【杰論系列】胰腺癌CAR-T安全療法的新靶點——CEACAM7

胰腺癌簡介及CAR-T細胞療法

胰腺導管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC)是第四大常見致死率高的的實體瘤，其5年存活率不足5%，因早期缺乏明確的癥狀，多數患者診斷時即為晚期，表現為廣泛轉移。傳統療法很難治愈PDAC，最多能延長幾個月的壽命， 并且PDAC存在顯著的遺傳異質性和腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell，CSC），這些都極大地促進了疾病的發展和對化療的耐藥性，因此亟需找到新的、更有效的靶向治療辦法。

CAR-T細胞療法在表達CD19的B細胞惡性腫瘤和血液瘤中顯示出顯著的療效，但在實體瘤中療效有限，主要原因是相比癌癥組織，CAR-T療法會給機體其他組織產生肯定的毒性影響，因為目前CAR-T細胞定向到胰腺癌細胞和其它實體瘤的大部分蛋白質也在其它正常組織中以低水平存在，從而就會誘發毒副作用的發生。因此缺乏在惡性細胞上高表達且在正常組織中不表達的CAR-T靶抗原來阻止靶向非腫瘤毒性。CEACAM7 (CGM2)是一個目前研究比較少的CEA家族蛋白成員，CEA家族蛋白具有多種功能，在惡性腫瘤中常見失調。研究發現CEACAM7其表達局限于結腸和胰腺，但該蛋白卻在一些正常組織中并不表達，本文推測CEACAM7或許能作為一種安全療法靶點幫忙開發治療胰腺癌的新型策略，并對此進行了研究，同時制備了CEACAM7靶向CAR-T細胞以驗證這一假說。

CEACAM7在PDAC腫瘤組織

和正常組織中的表達

為了評估CEACAM7蛋白在PDAC樣本中的表達情景，對一組人類PDAC腫瘤切片進行了免疫染色，結果顯示在30個腫瘤切片中有19個腫瘤切片呈CEACAM7中或高表達，11個腫瘤切片CEACAM7表達很低或檢測不到。為了進一步評估CEACAM7在正常組織中的表達，對與PDAC腫瘤切片相同的組織芯片上的正常組織切片進行免疫染色，結果顯示在正常胰腺或結腸組織中均未檢測到CEACAM7表達。研究發現CEACAM7其表達局限于結腸和胰腺，該蛋白在扁桃體、肺部組織、肝臟和前列腺正常組織中均未檢測到表達。這就表明，CEACAM7或許能作為一種理想的靶點幫忙開發治療胰腺癌的CAR-T細胞療法。

之前的研究報道CEACAM7可在胰腺和結腸中轉錄表達，本文從正常捐贈者的組織中分離RNA進行RT-PCR，結果發現這些組織中可檢測到CEACAM7的轉錄表達，與在細胞系和患者的原代細胞培養中的表達水平具有可比性。與PDAC原代細胞系相比，CEACAM7的抗原表達顯著升高，提示PDAC中CEACAM7蛋白的上調可能發生在轉錄后水平。進一步采用qRT-PCR來評估I-II期PDAC患者原代培養物中CEACAM7 mRNA轉錄本的表達。結果發現7個PDAC原代培養物中有3個細胞檢測到CEACAM7轉錄本表達上調，且在人類胰腺中低表達，在血細胞和非PDAC細胞類型中均未檢測到表達(圖1C)。同時發現CEACAM7在腫瘤干細胞富集的亞群中高表達，這表明CEACAM7有可能靶向腫瘤干細胞的要害區域(圖1C)。

為了進一步研究CEACAM7在正常組織中的表達水平，通過qRT-PCR分析了3個人類正常組織中CEACAM7的轉錄表達，組織包括腎臟、肺、骨骼和心肌、內臟和皮下脂肪、肝臟、大腦、卵巢和乳房，結果發現與原代培養的PDAC細胞系相比，在這些組織中均未檢測到CEACAM7表達(圖1D)。為研究CEACAM7轉錄本是否與PDAC中細胞表面CEACAM7表達相關，運用I-II期局部疾病患者的原代培養或晚期轉移性疾病患者的血源性CTCs，對2869雜交瘤細胞上清液進行流式細胞術檢測顯示3個轉移性PDAC培養物中有1個培養物CEACAM7高表達，5個I-II期PDAC培養物中有2個培養物CEACAM7高表達，同時發現大多數PDAC腫瘤的CEACAM7表達局限于上皮細胞的頂端表面。

圖1 CEACAM7在PDAC腫瘤組織和正常組織中的表達

開發靶向CEACAM7的

新型2869 CAR-T細胞

本文進一步研究2869雜交瘤細胞對CEACAM7的特異性。354和c102 PDAC培養物在貼壁培養時未檢出CEACAM7表達（圖1E)，對354和c102 PDAC培養物進行修飾來表達GFP和熒光素酶(354GL和c102GL)，以便在體內和體外進行跟蹤。為了評估2869抗體對CEACAM7蛋白的特異性，本文進一步修飾354GL和c102GL細胞來穩定表達CEACAM7。2869雜交瘤細胞上清的Western blotting結果顯示CEACAM7勝利異位表達，且CEACAM7在c102GL中的表達高于354GL(圖2A)。本文基于2869 抗體的重鏈和輕鏈的可變區生成了一個 scFv，將2869 scFv-Fc融合體轉染到293T細胞中，用含有分泌蛋白的上清液在修飾和未修飾的354GL上進行流式細胞術檢測，結果顯示2869 scFv - fc顯示了與2869雜交瘤上清相似的結合模式，2869 scFv-fc與異位表達CEACAM7的細胞特異性結合，證實了2869 scFv可用于開發靶向CEACAM7的CAR-T細胞(圖2D)。通過將2869單鏈抗體與鉸鏈結構域和CD8a跨膜結構域融合，在CD137（4-1BB）共刺激結構域和CD3z激活結構域的框架內構建第二代嵌合抗原受體，一些研究表明表位結合域與T細胞表面的距離可以顯著影響CAR-T細胞的功能，因此，本文針對CEACAM7蛋白的抗體的一部分結構制造出了兩種新型CAR，一個有45個氨基酸CD8α衍生鉸鏈，一個有12個氨基酸IgG4衍生鉸鏈 (圖2E)，兩種CAR都可以有效地轉導到人類T細胞中，表達量在40%到90%之間。

圖2 開發新型的2869 CAR-T細胞

2869 CAR-T細胞靶向CEACAM7的特異性

制造出了新型的CAR細胞，隨后修飾殺傷性T細胞使其能夠在表面上展示新型的CAR蛋白來辨認并結合CEACAM7，并能夠指揮殺傷性T細胞殺滅僅攜帶CEACAM7的細胞。為了研究2869 CAR對CEACAM7靶點的特異性和療效，將CEACAM7異位表達的354GL細胞和c102GL細胞作為CAR-T細胞的靶點，未修飾的細胞作為陰性對照。未修飾的T細胞或修飾后表達2869 CARs的T細胞，以5:1的E:T比例覆蓋在PDAC靶細胞的單層上。通過GFP表達來評估靶細胞的生機。與2869 CAR-T 細胞類型中的任一種共培養后，看見到 CEACAM7 表達的靶PDAC細胞裂解，但未修飾的細胞未看見到裂解(圖3A和B)。WST-1對靶細胞定量結果顯示2869 CAR-T細胞對未修飾的PDAC細胞沒有任何影響，當E:T比例為5:1和1:1時，CEACAM7表達的靶細胞生機升高。而細胞毒性殺傷好像與抗原密度相關，c102GL的細胞毒性高于354GL細胞，這與c102GL細胞中CEACAM7表達較高一致。當CAR - T細胞以E:T為5:1比例應用于任一靶細胞類型時，較小的2869 CAR細胞 (IgG4鉸鏈)具有稍微但顯著較高的細胞毒性功效(圖3C和D)。說明2869 CAR-T細胞有效靶向表達CEACAM7的貼壁生長的PDAC細胞——354GL細胞和c102GL細胞，而對不表達目標抗原的細胞沒有影響。

為檢驗T細胞穿透腫瘤微環境屏障的能力，將表達CEACAM7或不表達CEACAM7的354GL和c102GL細胞進行球體培養7天，然后以E:T為5:1添加效應T細胞，結果發現添加2869 CAR-T細胞后，表達CEACAM7的球形培養物完全溶解，而未修飾的不受影響。因此，研究表明2869 CAR-T細胞可以靶向表達CEACAM7的PDAC球體培養物，在體外條件下富集CSC并再現基質屏障。同時發現2869 CAR-T細胞在貼壁或球形培養下被目標抗原特異和有效地激活。

圖3 2869 CAR-T細胞的體外療效

為了評估CAR-T細胞活性是否在體內持續存在，本研究原位植入354GL細胞，構建了I/II期PDAC異種移植模型，此模型腫瘤移植并飛快擴張，并在腫瘤植入后第6天和第13天給予兩劑2869 CAR-T細胞治療(圖4A)，在354GL隊列中，腫瘤持續快速發展，所有小鼠在第23天腫瘤負荷明顯。在354GL±CEACAM7隊列中，腫瘤顯著消除，5只小鼠中有4只小鼠的腫瘤被完全清除(圖4B和C)，然而該隊列中的所有動物都死于移植物抗宿主病(GvHD)，并在第38天施行安樂死(圖4D)。為了研究2869 CAR-T細胞對更大、更成熟腫瘤的療效，本文采用354GL±CEACAM7細胞設立了第二種異種移植模型，并監測了腫瘤在體內生長的情景，當腫瘤達到肯定大小時，在第13天和第20天注射了兩劑2869 CAR-T細胞(圖4E)，354GL組的所有動物飛快死亡，而354GL±CEACAM7組的5只動物中有4只動物看見到腫瘤穩定且生活工夫被延長(圖4F和G)，說明了2869 CAR-T細胞對來自患者原發性PDAC培養的異種移植模型具有體內抗原特異性。

圖4 2869 CAR-T細胞的體內療效

2869CAR-T細胞靶向CEACAM7

表達的腫瘤細胞

患者來源的PDAC細胞系c76和253細胞在貼壁培養時CEACAM7的表達水平低于球體培養細胞(圖1E)，因此貼壁培養的c76和253細胞用來評估2869 CAR對內源性CEACAM7表達的活性。研究發現2869 CAR-T細胞使c76和253細胞單層裂解，而未修飾的T細胞則沒有影響(圖5A)。WST-1靶細胞定量結果顯示2869 CAR-T細胞以效應細胞劑量依靠的方式裂解兩種靶細胞，看見到E:T比例為 5:1比E:T比例為 1:1有更高的細胞毒性(圖5B)。同時2869 CAR-T細胞與靶細胞PDAC共培養時，看見到IFNg分泌增加(圖5C)。因此本文構建了一個具有類似細胞內共刺激和激活域的突變型CAR，但缺乏scFv表位結合域(圖5D)。與突變的CAR-T細胞相比，運用PDAC 253靶標的細胞毒性顯示2869 CAR-T細胞具有顯著的靶向裂解作用，表明2869 CAR-T細胞對CEACAM7具有特異性靶向作用(圖5F)。

圖5 2869 CAR - T細胞靶向原代PDAC細胞系中內源表達的CEACAM7

為了研究CEACAM7在更多細胞系中的表達，研究者構建了6個PDAC細胞系，顯示2869CAR-T細胞與所有細胞類型結合，與PDAC c76培養物的表達水平相似，低于修飾后的354GL細胞中CEACAM7的異位表達水平 (圖6A和B)。同時發現CEACAM7在PDAC細胞系和原代培養細胞中均表達，在細胞表面表達水平相似。為了進一步驗證2869 CAR的特異性，將354GL±CEACAM7與突變的CAR - T細胞或2869 CAR - T細胞共培養，E:T比例為3:1。顯微鏡和WST-1靶細胞定量結果證明2869 CAR - T細胞能夠特異性靶向CEACAM7表達的腫瘤細胞，而突變的CAR-T細胞對抗原表達或不表達的細胞系沒有影響(圖6C)。進一步運用2869 CAR-T和突變的CAR-T細胞作為對照，對所有6個PDAC細胞系進行了細胞毒性實驗。在E:T比為3:1和1:1時，所有PDAC細胞系與2869 CAR-T細胞共培養時均看見到顯著的細胞毒性。細胞毒性與PDAC原代培養物的細胞毒性相稱，但比異位表達354GL±CEACAM7的細胞低(圖6D和E)。這些數據進一步證實了2869 CAR-T細胞對CEACAM7表達的PDCA培養細胞的特異性。

圖6 2869 CAR - T細胞靶向CEACAM7表達的PDCA細胞系

2869CAR-T細胞可延緩PDCA患者來源的異種移植瘤的生長

將貼壁培養的PDAC c76GL細胞原位植入NSG小鼠。細胞取自于患有轉移性晚期PDAC患者的血液，具有侵襲性強、生長快速且廣泛轉移特點。監測腫瘤大小達到>0.5 cm3，并且出現可檢測的轉移，來正確模仿人類患者晚期疾病表現。在這個階段，給動物注射5*106突變的CAR-T細胞或2869 CAR-T細胞(圖7A)。運用突變的CAR-T細胞治療的5只動物全部看見到腫瘤持續發展，2869 CAR-T細胞治療的5只動物中只有2只看見到腫瘤的持續發展。在2869 CAR-T細胞隊列的應答動物中看見到原發腫瘤和肝轉移完全消除(圖7B和C)。同時發現2869 CAR-T治療組的總生活期明顯優于突變的CAR-T治療組。因此，這些結果表明2869 CAR-T細胞可延緩患者來源的異種移植瘤的生長，在侵襲性和轉移性的異種移植模型中引起大腫瘤和轉移的完全消除。

圖7 2869 CAR - T細胞在體內靶向彌散性異種移植腫瘤

結論

本研究表明CEACAM7確定為PDAC的潛在安全治療靶點，而且構建了靶向CEACAM7的CAR-T細胞，并通過體外和體內模型評估CEACAM7 CAR-T細胞的抗腫瘤療效。靶向CEACAM7的CAR-T細胞能夠靶向抗原表達的胰腺癌細胞，而對非腫瘤組織沒有明顯的毒性，并可延緩患者來源的異種移植瘤的生長。

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參考文獻：

Raj D, Nikolaidi M, Garces I, et al. CEACAM7 Is an Effective Target for CAR T-cell Therapy of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Cancer Research. 2021.

內容：市場部 許曉雪

編輯：Sally

校正：Chao.Z/Grace/Sally

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